黃曲霉毒素是一種肝臟毒素，對(duì)人和許多動(dòng)物都有極強(qiáng)的致癌性，其中黃曲霉毒素B1毒性最大，致癌性最強(qiáng)。因此，食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)是非常重要的。下面介紹的分離及測(cè)定黃曲霉毒素的方法——薄層色譜法（TLC）是常規(guī)分析中常用的一種重要方法。
　　一、 原理
　　樣品中黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定含量。
　　二、 試劑
　　（一） 三氯甲烷。
　　（二） 石油醚（沸程30℃~60℃或60℃~90℃）。
　　（三） 甲醇。
　　（四） 苯。
　　（五） 乙腈。
　　（六） 無(wú)水乙醚或乙醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水。
　　（七） 丙酮。
　　以上試劑在試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行1次試劑空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則逐一檢查進(jìn)行重蒸。
　　（八） 苯-乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混勻。
　　（九） 硅膠G：薄層色譜用。
　　（十） 三氟乙酸。
　　（十一） 無(wú)水硫酸鈉。
　　（十二） 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。
　　1． 貯備液的制備：精密稱取1mg~1.2mg的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。該標(biāo)準(zhǔn)溶液約為10μg/mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)此標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收峰的波長(zhǎng)及該波長(zhǎng)的吸光度值，并按下式計(jì)算此標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。 式中：X1黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg/mL；A——測(cè)得的吸光度值；312——黃曲霉毒素B1的分子量；19800——黃曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩爾消光系統(tǒng)；f——使用儀器校正因素；用c（K2Cr2O7）=0.0004mol/L，c（K2Cr2O7）=0.002mol/L，c（K2Cr2O7）=0.0001mol/L三種溶液，以1cm石英杯，在最大吸收峰的波長(zhǎng)（接近350mm）處用硫酸溶液（0.5mL硫酸+1000mL水）作空白，測(cè)以上三種溶液的吸光度（A），并按式E=A/c計(jì)算平均摩爾消光系數(shù)，再按式f=3160/E求出使用儀器的校正因素。若f大于0.95或小于1.05，則使用儀器的校正因素可略而不計(jì)。
　　根據(jù)計(jì)算，用苯-乙腈（98+2）混合液調(diào)到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度恰為10μg/mL，并用分光光度計(jì)核對(duì)其濃度。
　　2． 純度的測(cè)定：取5μL（10μg/mL）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴加于薄層板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）與丙酮-三氯甲烷（8+92）展開(kāi)劑展開(kāi)，在紫外燈下觀察熒光的產(chǎn)生：只有單一的熒光點(diǎn)，無(wú)其他雜質(zhì)熒光點(diǎn)，原點(diǎn)上沒(méi)有任何殘留的熒光物質(zhì)。
　　（十三） 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液：用苯-乙腈混合液準(zhǔn)確稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至每毫升相當(dāng)于0.2μg及0.04μg黃曲霉毒素B1。
　　三、 儀器
　　（一） 分光光度計(jì)。
　　（二） 烘箱。
　　（三） 索氏抽提器。
　　（四） 電熱恒溫水浴。
　　（五） 電動(dòng)振蕩器。
　　（六） 玻璃板：5cm×20cm
　　（七） 薄層板涂布器。
　　（八） 展開(kāi)槽：內(nèi)長(zhǎng)25cm寬6cm、高4cm。
　　（九） 紫外光燈：100W~125W，帶有波長(zhǎng)365nm濾光片。
　　（十） 微量注射器。
　　四、 操作步驟
　　由于月餅類糕點(diǎn)中含有大量油脂，為了使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確，必須先除去油脂后再進(jìn)行測(cè)定。因黃曲霉毒素易溶解在油脂中，為了達(dá)到既要除去油脂便于測(cè)定，又要保證樣品中含有的黃曲霉毒素不被油脂帶走而造成測(cè)定結(jié)果偏差。因此，應(yīng)先將黃曲霉毒素從油脂中“趕”出來(lái)，然后再除去油脂。根據(jù)黃曲霉毒素不溶在乙醚或石油醚中，而油脂易溶于其中的特性，用乙醚或石油醚除去油脂就可達(dá)到目的。
　　（一） 去油脂
　　稱取20g樣品，放入濾紙筒內(nèi)，筒兩端塞以少許脫脂棉，置于索氏抽提器內(nèi)，在250mL油脂瓶?jī)?nèi)加入180mL-200mL石油醚，于70℃~80℃水浴上加熱回流提取油脂，抽提6h以上。除油脂完畢后，將濾紙筒取出放在瓷盤中避光自燃揮干備用，回收石油醚。
　　（二） 提取
　　將濾紙筒內(nèi)除去油脂后的樣品轉(zhuǎn)入250mL具塞錐形瓶中，用6mL水濕潤(rùn)，準(zhǔn)確加入60mL三氯甲烷，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴(yán)，振搖30min，加入12g無(wú)水硫酸鈉脫水，靜置30min以上，用快速定性濾紙過(guò)濾于100mL具塞錐形瓶中，取12.00mL 濾液（相當(dāng)4g）樣品）于蒸發(fā)皿中，在65℃水浴上于通風(fēng)柜內(nèi)揮干，然后放在冰盒上冷卻2min~3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈（98+2）混合液。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)�充分混合，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取下，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中蓋嚴(yán)備用。
　　（三） 測(cè)定
　　1． 薄層板的制備
　　稱取約3g硅膠G，加入2~3倍左右的水，涂成5cm×20cm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15min后，置100℃活化2h。
　　2． 點(diǎn)樣
　　在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1cm，點(diǎn)直徑約3mm。在同一板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吹邊加。滴加樣式如下：
　　第一點(diǎn)：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。
　　第二點(diǎn)20μL樣液。
　　3． 展開(kāi)與觀察
　　在展開(kāi)槽內(nèi)加10mL無(wú)水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開(kāi)槽內(nèi)加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開(kāi)10cm，取出揮干后在365nm紫外光下觀察結(jié)果。如果第二點(diǎn)在與第一點(diǎn)相同的比移值位置上無(wú)藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示樣品中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。
　　4． 確證實(shí)驗(yàn)
　　于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。
　　第一點(diǎn)：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。
　　第二點(diǎn)：20μL樣液。
　　于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min（熱風(fēng)溫度低于40℃），再于薄層板上滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。
　　第三點(diǎn)：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。
　　第四點(diǎn)：20μL樣液。
　　再展開(kāi)（見(jiàn)上3）。在紫外光燈下觀察，在黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相同位置上，樣液也出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光點(diǎn)為陽(yáng)性，否則為陰性。未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。
　　5． 稀釋定量
　　樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量（0.0004μg）的熒光強(qiáng)度一致，則樣品中黃曲霉毒素B1含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)或?qū)�樣液稀釋后再滴加不同微升�?shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一至致為止。滴加式樣如下：
　　第一點(diǎn)：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。
　　第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10μL樣液。
　　第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15μL樣液。
　　第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20μL樣液。
　　6． 計(jì)算
　　式中：X2——樣品中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；V1——加入苯-乙腈混合液的體積，mL；V2——出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，mL；m——加入苯-乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g；0.0004——黃曲霉毒素B1最低檢出量，μg。
　　五、 總結(jié)及注意事項(xiàng)
　　（一） 本實(shí)驗(yàn)只有在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)沒(méi)有揮發(fā)性試劑時(shí)，才能進(jìn)行操作。或者在點(diǎn)樣（只能暴露點(diǎn)樣面積）時(shí)及展開(kāi)并干燥以后，在薄層板的上面放1塊潔凈的玻璃板保護(hù)吸附層。
　　（二） 薄層板在暴露于紫外光之前要始終保持干燥。當(dāng)吸附劑表面接觸太陽(yáng)光或熒光燈的紫外光線（尤其是存在溶劑）時(shí)，紫外光級(jí)催化所檢驗(yàn)的化合的發(fā)生變化。為了顯色，要避免未展開(kāi)的斑點(diǎn)接觸紫外光線。
　　（三） 如環(huán)境比較潮濕，薄層板的活性易降低，將影響測(cè)定的靈敏度。因此，應(yīng)在使用當(dāng)天活化，且點(diǎn)板也宜在有硅膠干燥劑的展開(kāi)槽內(nèi)進(jìn)行。
　　（四） 由于黃曲霉毒素B1劇毒并強(qiáng)致癌，操作時(shí)應(yīng)特別小心，注意防護(hù)及清洗消毒。受污染的器皿，經(jīng)次氯酸鈉溶液（5%）浸泡片刻后再清洗干凈即可達(dá)到去毒效果。中國(guó)糧油儀器在線 http://www.jiansheschool.com